ISOLASI DNA

 PERCOBAAN II

“ISOLASI DNA”

I.              Tujuan

          Adapun tujuan percobaan ini adalah untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis buah-buahan

II.              Dasar Teori

           DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Ridwan, 2010).

                 DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya. Asam ribonukleat terdiri benang panjang ribonukleotida. Walaupun molekul ini jauh lebih pendek dari DNA, RNA ditemukan dalam jumlah yangt jauh lebih banyak di dalam kebanyakan sel. Pada sel prokariotik dan eukariotik, ketiga golongan utama RNA adalah RAN data (mRNA = messenger RNA), RNA Ribosom (rRNA), dan RNA pemindah (tRNA = transfer RNA). Masing-masing terdiri dari satu rantai ribonukleotida, dan masing-masing mempunyai molekul urutan nukleotida, dan fungsi biologis yang khas. DNA mengandung 2 basa pirimidin utama, sitosin (C) dan timin (T), dan dua basa urin utama adenine (A) dan guanin (G). RNA juga mengandung dua pirimidin utama sitosin (C) dan urasil (U), dan dua basa purin, adenine (A) dan guanine (G). Seperti pada gamber berikut :

      Adapula perbedaan antara DNA dan RNA yaitu :

Pembanding	RNA	DNA
Letak	Nukleus mitokondria, kloroplas, sitoplasma dan ribosom	Nukles, kloroplas dan mitokondria
Fungsi	Umumnya sintesis protein	Pembawa informasi genetic dan sintesis protein
Rantai	Tunggal dan tidak terpilin	Tangga tali terpilin (double helix)
Kadar	Berubah-ubah tergantung aktivitas sintesis protein	Tetap
Gula pentosa	Ribose	Deoxiribosa
Basa Nitrogen	Pirimidin: Urasil dan Citosin/ Sitosin	Pirimidin: Timin dan Sitosin/ Citosin

                                                                                                                             (Muslimah, 2011).

                  Pada dasarnya Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Krisman, 2011).

    Tahap Isolasi DNA

1.      Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

2.      Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan  larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

3.      Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

4.      Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

5.      Presipitasi

Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas ( Anonim, 2010).

Manfaat isolasi DNA

          Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensic perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan             (Aisyatun, 2013).

III.              Alat dan Bahan

        Adapun alat dan bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah sebagai berikut :

A.  Alat

1.      Sendok dan garpu

2.      Corong

3.      Tabung reaksi

4.      Rak tabung reaksi

5.      Pisau

6.      Batang pengaduk

7.      Spatula

8.      Loyang

9.      Erlenmeyer

10.  Kertas label

11.  Kertas saring

12.  Aqua plastik

13.  Kaca arloji

14.  Talenan

15.  Neraca digital

B.   Bahan

1.         Buah Sirsak

2.         Buah Pepaya

3.         Buah Pisang

4.         Buah Mangga

5.         Buah Semangka

6.         Buah Alpukat

7.         Buah Nanas

8.         Buah Nangka

9.         Sabun sunlight

10.     Aquades

11.     Etanol absolut dingin

12.     Garam dapur (NaCl)

13.     Es batu

IV.              Prosedur Kerja

          Adapun prosedur kerja yang dilakukan pada percobaan ini adalah sebagai berikut :

1.   Mengupas dan memotong-motong kecil buah pisang, kemudian melumatkan  buah tersebut hingga halus.

2.   Menambah 8 gram garam dapur lalu melumatkannya kembali secara berlahan-lahan.

3.   Menambahkan campuran sunlight dan aquades dengan perbandingan 1 : 1, kemudian menambahkan lagi dengan 20 mL aquades.

4.   Mengaduknya secara perlahan hingga homogen kemudian mendiamkannya selama + 15 menit.

5.   Menyaring ekstrak dan memasukkan filtratnya ke dalam tabung reaksi sekitar  volume tabung reaksi.

6.   Menambahkan etanol absolut dingin dengan cara mengalirkannya melalui dinding tabung reaksi secara perlahan.

7.   Mengamati pemisahan massa bening (DNA) dari ekstrak buah.

8.   Mengambil gambar hasil yang diperoleh.

9.   Hasil positif terlihat adanya 3 lapisan yaitu lapisan di dasar tabung adalah ekstrak buah, lapisan tengah berisi etanol dan lapisan ketiga massa putih (DNA).

10.  Mengulangi langkah 1 – 7 dengan menggunakan buah sirsak, pepaya, mangga, semangka, alpukat, nenas, dan nangka.

V.            Hasil Pengamatan

                 Adapun hasil pengamatan yang diperoleh dari percobaan ini yaitu sebagai berikut :

      Adapun hasil pengamatan yang diperoleh pada percobaan ini yaitu sebagai berikut :

No	Perlakuan	Hasil Pengamatan
1.	Ø  Buah Pisang a.       Buah pisang dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin	Berwarna putih kekuningan Berwarna putih Berwarna hijau kebiruan - Filtrat  : Bening keputihan - Residu : Hijau kebiruan Tidak terbentuk untaian DNA
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.	Ø Buah Sirsak a.       Buah sirsak dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin Ø Buah Pepaya a.       Buah pepaya dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin Ø Buah Mangga a.       Buah mangga dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin Ø Buah Semangka a.       Buah semangka dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin Ø Buah Alpukat a.       Buah alpukat dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin Ø Buah Nenas a.       Buah nenas dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin Ø Buah Nenas a.       Buah nenas dipotong-potong kemudian dilumatkan b.      Perlakuan a + NaCl c.       Perlakuan b + Sabun d.      Menyaring e.       Perlakuan d + Etanol absolut dingin	Berwarna putih Berwarna putih Berwarna hijau kebiruan - Filtrat  : Bening kekuningan - Residu : Hijau kebiruan Terbentuk untaian DNA Berwarna orange Berwarna orange Berwarna hijau tua - Filtrat  : Bening kehijauan - Residu : Hijau tua Tidak terbentuk untaian DNA Berwarna kuning Berwarna kuning Berwarna hijau - Filtrat  : Bening kekuningan - Residu : Hijau Terbemtuk untaian DNA Berwarna merah Berwarna merah Berwarna hijau kebiruan - Filtrat  : Bening kemerahan - Residu : Hijau kebiruan Tidak terbemtuk untaian DNA Berwarna hijau Berwarna hijau keputihan Berwarna hijau - Filtrat  : Bening kehijauan - Residu : Hijau Tidak terbemtuk untaian DNA Berwarna kuning Berwarna kuning keputihan Berwarna hijau - Filtrat  : Bening kekuningan - Residu : Hijau Tidak terbemtuk untaian DNA Berwarna kuning Berwarna kuning keputihan Berwarna hijau - Filtrat  : Kuning keputihan - Residu : Hijau Tidak terbemtuk untaian DNA

  

 VI.                        Pembahasan

                  DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan (Muslimah, 2011).

                  Pada dasarnya Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.  Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA (Krisman, 2011).

                  Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang), penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan             (Aisyatun, 2013).

                  Secara umum tujuan dari dilakukannya percobaan ini yaitu untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis buah-buahan. Adapun buah-buahan yang digunakan yaitu buah pisang, buah sirsak, buah pepaya, buah mangga, buah semangka, buah alpukat, buah nanas, dan buah nangka (Tim Penyusun, 2013).

                  Pada perlakuan awal, yaitu mengupas kulit buah diisolasi DNA-nya. Kemudian dilakukan pelumatan buah tersebut dengan menggunakan garpu atau sendok. Proses pelumatan ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ekstraksi ini harus dilakukan dengan sebaik mungkin dan secara hati-hati, agar tidak terjadi kerusakan pada DNA dari buah tersebut. Selanjutnya, menambahkan 8 gram garam dapur (NaCl) pada masing-masing hasil pelumatan sampel buah yang ada. Penambahan garam ini bertujuan untuk memekatkan DNA. Ion Na⁺ yang terkandung dalam garam akan mampu membentuk ikatan dengan kutub negatif pada ikatan fosfat DNA, saat ion Na⁺  dari garam tersebut berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul atau memekat. Setelah itu, menambahkan campuran sabun sunlight dan aquades 1 : 1. Penambahan ini bertujuan untuk merusak membran sel dan membran plasma yang terdapat di dalam buah tersebut, dimana perusakan ini terjadi melalui ikatan yang dibentuk pada sisi hidrofobik sabun dengan protein dan lemak, pada membran sel membentuk senyawa lipid-protein-sabun kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena pada protein dan lipid yang memiliki ujung hidrofobik dan hidrofilik. Demikian juga dengan sabun sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia dan diperoleh DNA dari tanaman tersebut. Kemudian menambahkan dengan 20 mL aqaudes, tujuannya untuk melarutkan semua zat yang ditambahkan seperti garam dan sabun dan mengaduknya secara perlahan agar tidak merusak struktur DNA. Selain itu tujuan pengadukan agar larutan bercampur hingga homogen. Selanjutnya mendiamkan selama + 15 menit, tujuannya untuk merekasikan semua zat-zat yang ada dalam larutan tersebut (Tim Penyusun, 2013).

                  Pada perlakuan berikutnya, melakukan penyaringan larutan dan memasukkan filtrat hasil penyaringan tersebut ke dalam tabung reaksi. Penyaringan ini bertujuan agar komponen-komponen sel lainnya yang tidak diinginkan selain sampel DNA, tidak mengkontaminasi sampel DNA buah yang akan diisolasi. Selain itu, penyaringan ini bertujuan untuk memisahkan antara residu dan filtratnya. Kemudian menambakan etanol absolut dingin melalui dinding tabung yang bertujuan agar tidak merusak proses pemurnian DNA pada bagian tengah. Penambahan ini juga berfungsi sebagai pengkoagulan DNA, dimana molekul etanol absolut dingin yang tak bermuatan akan menarik molekul DNA yang bermuatan negative sehingga terjadi koagulasi atau penggumpalan. Sehingga DNA yang bersifat transparan dapat terlihat dengan jelas berupa benang-benang halus pada lapisan tengah campuran buah dan sabun. Etanol yang digunakan harus dalam keadaan dingin, sebab jika etanol tersebut dalam keadaan panas, maka DNA yang terkandung dalam ekstrak buah akan mengalami denaturasi (kerusakaan) sehingga tidak dapat teramati (Lehninger, 1982).

                  Setelah penambahan etanol, beberapa saat kemudian akan terbentuklah tiga lapisan di dalam larutan tersebut, dimana etanol absolut berada pada lapisan atas, kemudian pada lapisan tengah asam nukleat atau massa putih DNA, sedangkan pada lapisan ketiga yang berada paling bawah adalah filtrat buah. Terbentuknya 3 lapisan ini diakibatkan perbedaan massa jenis dari ketiga senyawa tersebut. Hasil positif yang terlihat pada percobaan yang telah kami lakukan merupakan suatu hasil yang dapat membuktikan serta menunjukkan cara isolasi DNA tumbuhan (Krisman, 2011).

                  Berdasarkan percobaan yang dilakukan, warna ekstrak dari masing buah-buahan berbeda-beda. Hal ini disebabkan karena perbedaan susunan DNA yang terdapat dalam tiap buah. Dimana struktur DNA memiliki ciri khas untuk setiap buah, meski hanya disusun dari sitosin (C), timin (T), adenine (A) dan guanin (G), tetapi perbedaan susunan kombinasinya di dalam sel makhluk hidup dapat menyebabkan ciri khusus untuk tiap buah. Selain itu, dari hasil yang diperoleh, banyaknya lapisan endapan asam nukleat yang diperoleh dari tiap-tiap sampel buah yang berbeda-beda. Hal ini disebabkan karena perbedaan sifat serta struktur dari ekstrak buah tersebut. Selain itu, pada percobaan ini hanya sampel buah pepaya sajay yang dapat dibentuk untaian DNA-nya selebihnya dari sampel tidak terbentuk. Hal ini dikarenakan adanya kesalahan dari praktikan pada saat pelumatan dan eksraksi, dimana DNA dari buah tersebut mengalami kerusakan  (Anonim, 2010).

                  Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Krisman, 2011).

VII.                        Kesimpulan

     Berdasarkan tujuan dan hasil pengamatan maka dapat ditarik kesimpulan dari percobaan ini yaitu DNA dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah-buahan dengan cara mengekstrak sari buah dan selanjutnya melakukan penambahan larutan garam (NaCl), detergen dan etanol absolut dingin untuk membantu koagulasi dalam pembentukan benang-benang DNA pada setiap sampel buah.

  

Daftar Pustaka

Aisyatun, Nur. (2013). Isolasi DNA. http://aisyatunnurlaelyshare.wordpress.com/2013/04/24/isolasi-dna 

              Diakses pada tanggal 18 desember 2013

Anonim. (2010). Isolasi Dna. http://www.macnature.com.

               Diakses pada tanggal 18 desember 2013

Krisman. (2011). Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebly.com.

               Diakses pada tanggal 18 desember 2013

Lehninger, Albert. L. (1982). Dasar-Dasar Biokimia Jidid 1. Jakarta:Erlangga.

Muslimah. (2011). Isolasi DNA. http://muslimahsakura90.wordpress.com.

               Diakses pada tanggal 18 desember 2013

Ridwan, Maulana. (2013). Laporan isolasi DNA dan Elektroforesis DNA. http://ridwanmaulana.blogspot.com/2013/06/laporan-isolasi-dna-elekroforesis.html. Diakses pada tanggal 18 desember 2013

Tim Penyusun Biokimia. (2013). Penuntun Praktikum Biokimia Dasar. Palu:Universitas  Tadulako.